对于各种慢性疾病，如2型糖尿病、痴呆症、肌肉减少症和心脏病，运动仍然是目前最有效的治疗方法。运动的很多长期好处归因于肌肉收缩，这些好处包括增加能量消耗、清除异位脂质储存、改善胰岛素敏感性、降低循环胰岛素水平、增加运动调控肌动蛋白（如白介素-6或鸢尾素）和胞外囊泡分泌等，然而引发上述运动适应性的分子机制仍不十分清楚。2019年8月5日，国际专业学术期刊The EMBO Journal（IF：11.227）在线发表了悉尼大学查尔斯·珀金斯中心的David E. James课题组关于运动适应性调控的最新研究成果。作者利用小鼠跑步运动模型和大鼠原位肌肉收缩模型，对骨骼肌进行磷酸化蛋白质组学检测，鉴定到22000多个磷酸化位点，揭示了受运动调控的直系同源蛋白的磷酸化位点和共同的信号通路。
研究发现，AMPK和Ca2+信号传导通路被高度富集，而STIM1是造成两条通路串扰的关键蛋白。STIM1上有2个位点能够被AMPK磷酸化（S257和S521），AMPK引起的S257磷酸化能够影响STIM1的构象并负调控SOCE，这可能是肌肉运动适应和延迟疲劳的重要机制。该研究揭示了庞大的运动调控信号网络，为进一步探索蛋白质磷酸化及其在组织运动适应中的调控作用打开了大门。这项跨物种研究不但为运动模型的开发和使用提供信息，并且有助于发现新的治疗靶点。钙池操纵性钙内流（store-operated calcium entry，SOCE）是介导胞外Ca2+进入细胞内的重要方式之一，其核心蛋白由位于内质网上的基质相互作用分子（stromal interaction molecule，STIM）和位于细胞膜上的Orai蛋白构成。目前研究发现，STIM蛋白存在STIM1和STIM2两种亚型，其主要功能略有不同。当内质网钙池中Ca2+消耗之后，STIM蛋白发生快速的转位和聚合化等激活反应，与Orai蛋白偶联，实现SOCE通路的功能开放，引起Ca2+内流。当钙池中Ca2+得到补充之后，STIM蛋白与Orai蛋白缓慢解离，通路关闭。
本研究中作者分别针对原位电刺激的大鼠肌肉收缩模型和小鼠跑步运动模型，进行了高深度的磷酸化蛋白组学检测，并与之前发布的人类单车运动的数据集进行了整合分析。
研究者利用TMT标记定量的方法分别对大鼠和小鼠的骨骼肌进行了高深度的磷酸化蛋白质组学检测（图1A）。结果显示，组内生物学重复之间的相关性显著高于组间，表示定量重复性较好（图1B）。在大鼠骨骼肌样品中，总共定量了8989个独特的磷酸化肽段；而在小鼠骨骼肌样品中，总共定量了9722个独特的磷酸化肽段（图1C）。差异表达的磷酸化位点分别为1887和1752个（图1C和D）。作者接下来利用PhosphOrtholog数据库（Chaudhuri et al，2015）比较了人、大鼠和小鼠骨骼肌中直系同源的磷酸化位点，鉴定到三个物种所共有的位点为1726个，其中只有67个位点受到显著调控，重叠度较低（图1C）。
为了降低物种差异对精确位点分析的影响，作者创造了“序列窗口”来识别蛋白质同一区域内可能具有相似功能的被调控的磷酸化位点。该方法确实扩大了三个运动模型之间磷酸化位点的数目（190个）。尽管这些位点不一定是直系同源的，但这些磷酸化簇可能在调控蛋白质功能中有相似的作用。此外，作者还对含有被调控的磷酸化位点的蛋白质进行了生物通路富集分析，显示出三个运动模型之间具有极好的一致性，这表明，尽管在模型之间观察到底物磷酸化的差异，但在更高的通路水平上可能存在功能趋同。图1. 大鼠和小鼠骨骼肌的磷酸化蛋白质组学流程以及生物信息学分析
为了研究激酶活性，作者将磷酸化位点映射到PhosphoSitePlus（PSP）数据库以检索激酶和底物关系（kinase: substrate relationships，KSRs），并根据底物磷酸化变化的方向进行富集分析（图2A；q值< 0.05）。富集分析显示，在所有三个数据集上，AMPK是唯一具有显著富集活性的激酶。AMPK已被证明通过强度超过最大有氧能力60%的运动或长期低强度运动而被激活。Akt/mTORC2和mTORC1/S6K信号活性在人类单车和小鼠跑步运动时降低；而在大鼠肌肉收缩时这些激酶的一些底物磷酸化增加，包括TSC2、AKT2和RPTOR。作者的激酶活性分析鉴定到模型之间的分歧点，这些分歧点为将来进行运动刺激骨骼肌适应性的研究时，提供合适的模型指导原则。
AMPK和Ca2+信号通路是三种运动模型中共同富集的生物通路，其中STIM1是实现两条信号通路间串扰的关键蛋白。STIM1存在三个直系同源的磷酸化位点，其中两个位点（S257和S521）被预测为AMPK磷酸化位点（图2A）。作者利用磷酸化位点特异性抗体，在肌肉和细胞层面验证了AMPK能够引起STIM1磷酸化（图2B-D），并进一步通过体外激酶实验确定S257和S521是AMPK直接的底物磷酸化位点（图2E）。此外作者还通过毒胡萝卜内酯处理实验证实，细胞溶质中Ca2+的升高会导致STIM1磷酸化增强，而AMPK则是参与这一过程的必要因素（图2F和G）。
图2. STIM1是一个新的受运动调控的AMPK底物
4、AMPK通过对STIM1的磷酸化影响其构象和活性
为了研究了STIM1磷酸化对其构象的影响，作者构建了一个STIM1-OASF（Orai1激活小片段）佛斯特共振能量转移（FRET）传感器，然后在L6成肌细胞中进行了荧光寿命成像显微镜（FLIM）检测。结果显示S257的磷酸化会产生折叠的、非活性的STIM1构象，而S521的磷酸化则无此现象。紧接着作者又通过药物处理结合敲降、点突变和回补等一系列实验，证实S257的磷酸化会导致STIM1活性降低，从而限制了SCOE（图3）。
图3. AMPK通过对STIM1的磷酸化来抑制SOCE
最后，作者利用果蝇的负趋地性攀爬实验来研究S257的磷酸化与运动能力之间的关系。结果显示S257的磷酸化能够使果蝇的肌肉疲劳度降低，延长攀爬的持续时间；而磷酸化丧失型突变（S257A）则使得果蝇更容易疲劳（图4）。上述运动实验进一步证明AMPK-STIM1轴的激活能够限制SOCE过程，是生物体肌肉运动适应的一种重要调控方式。
图4. 降低STIM1表达或增加其磷酸化水平，能够抑制运动造成的疲劳
Marin E Nelson, et al., 2019, Phosphoproteomics reveals conserved exercise-stimulated signaling and AMPK regulation of store-operated calcium entry. The EMBO Journal.